Giải trình tự bằng phương pháp Sanger – Chick Golden

Nguyên lý của giải trình tự bằng Sanger

Giải trình tự DNA theo giải pháp Sanger được tăng trưởng bởi nhà hoá sinh học người Anh Fred Sanger và tập sự vào năm 1977 .Phương pháp này tiến hành dựa trên kỹ thuật thông dụng là “ chain termination – kết thúc chuỗi ” bằng việc sử dụng những deoxy nucleotide đã bị chỉnh sửa làm mất nhóm hydroxyl ở đầu 3 ’ của phân tử đường. Nhóm 3 ’ – OH đóng vai trò được được cho phép gắn thêm một nucleotide mới vào chuỗi. Khi một ddNTP được thêm vào chuỗi, vì không có nhóm 3 ’ – OH nên một nucleotide không được thêm vào, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại. Enzyme polymerase xúc tác phản ứng gắn những dNTP vào mạch đơn của DNA để lê dài mạch ở vị trí 3 ’ – OH và dừng lại nếu gắn những ddNTP vào chuỗi. Trong một phản ứng chứa cả dNTP và ddNTP nên sau phản ứng tổng hợp, hình thành những đoạn DNA có độ dài khác nhau do ddNTP gắn ngẫu nhiên làm dừng phản ứng. Dựa vào sự sai khác về độ dài những đoạn DNA hiển thị trên bản gel sau điện di để xác lập trình tự trong gene .

Các bước thực hiện

Giải trình tự DNA theo Sanger triển khai những bước giống kỹ thuật PCR, trong đó thành phần của phản ứng gồm có những chất thiết yếu để nhân bản DNA :

Bạn đang đọc: Giải trình tự bằng phương pháp Sanger

• Một enzyme DNA polymerase: xúc tác phản ứng kéo dài mạch;
• Một primer: là một đoạn DNA sợi đơn ngắn kết hợp với DNA, là trình tự khởi đầu cho polymerase;
• Trình tự DNA
• 4 loại deoxy nucleotide DNA (dATP, dTTP, dCTP, dGTP).
• 4 loại dideoxy nucleotide (ddATP, ddTTP, ddCTP, ddGTP) được đánh dấu đồng vị phóng xạ. 

Trong thí nghiệm của Sanger, sử dụng 4 ống nghiệm chứa 4 loại ddNTP khác nhau được ghi lại đồng vị phóng xạ đồng thời được triển khai phản ứng tổng hợp. Sau đó mẫu sản phẩm của 4 ống nghiệm được điện di hiện hình đồng vị phóng xạ trên cùng một bản gel để quan sát những band DNA.

Căn cứ vào vị trí các vạch quan sát được trên bản gel mà xác định trình tự các nucleotide theo chiều từ 5 -3 từ dưới lên trên.

Ngày nay người ta sử dụng những máy giải trình tự động hóa để sắp xếp trình tự những band điện di. Kỹ thuật giải trình tự DNA tự động hóa ( Dye temination sequencing ) sử dụng những ddNTP có ghi lại huỳnh quang đã giúp cho việc sắp xếp trình tự DNA trở nên nhanh gọn và hiệu suất cao hơn. Mỗi loại ddNTP được gắn một màu có bước sóng phát xạ huỳnh quang khác nhau được cho phép triển khai giải trình tự trong một phản ứng duy nhất .

Hệ thống điện di mao quản được sử dụng để đọc trình tự DNA một cách tự động hóa. Cấu tạo của máy gồm 16 mao quản chứa gel polyacrylamide được cho phép nghiên cứu và phân tích nhiều mẫu trong một lần điện di. Hệ thống detector gồm những camera có chùm tia laser đi qua nó để ghi nhận tín hiệu huỳnh quang một cách đúng mực. Nguyên tắc hoạt động giải trí của máy là trong suốt quy trình điện di, khi có một vạch điện di đi qua chùm tia laser thì vạch điện di sẽ phát sáng và được camera ghi nhận và lưu lại thành một cường độ đỉnh sáng ( peak ) trong biểu đồ. Từ biểu đồ của những đỉnh cường độ sáng này, máy sẽ so dòng của những đỉnh tương ứng với nhau và nghiên cứu và phân tích thành trình tự của đoạn DNA.  

Ưu nhược điểm của giải trình tự Sanger

Giải trình tự Sanger trọn vẹn hoàn toàn có thể thực thi với những đoạn DNA tương đối dài ( khoảng chừng 900 cặp base ). Tuy nhiên, giải trình tự DNA theo chiêu thức Sanger là tốn kém và không hiệu suất cao cho những dự án Bất Động Sản Bất Động Sản Nhà Đất có quy mô lớn hơn, như trình tự hàng loạt hệ gen hay metagenome .

Source: http://wp.ftn61.com
Category: Hỏi Đáp